地高辛是一種類固醇激素的半抗原，又稱之為異甲基洋地黃毒苷配基，大自然中僅在洋地黃綠色植物中發(fā)覺，因而別的生物中不帶有抗地高辛的抗原，防止了選用別的半抗原作標(biāo)記很有可能產(chǎn)生的環(huán)境難題。
地高辛與抗地高辛抗原能產(chǎn)生免疫力融合，運(yùn)用抗地高辛抗原上具有的酶標(biāo)記就可開展探針的檢驗(yàn)。
選用人為辦法能夠?qū)⒌馗咝恋木€形間距臂與dUTP相互連接,產(chǎn)生DIG-11-dUTP，根據(jù)任意引物法或PCR法將其摻加到DNA中。
RNA探針的標(biāo)記是應(yīng)用噬菌體信息內(nèi)容編號(hào)的RNA聚合酶，根據(jù)身體之外基因表達(dá)將DIG-11-dUTP摻加到
RNA探針中。
寡核苷酸探針的標(biāo)記則是根據(jù)尾端轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)，在3'尾端再加上DIG-11-dUTP/dATP或DIG-11-ddUTP小尾巴。
地高辛標(biāo)記核苷酸探針的關(guān)鍵標(biāo)記方式
DNA的標(biāo)記方式
PCR摻加法
這類標(biāo)記方式是根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)，在Taq水解作用下，將DIG-11-dUTP摻加到新合成的DNA鏈中。
以此方法標(biāo)記的探針不僅敏感度高，生產(chǎn)量也很高。小量的基因DNA(1ng～50ng)便可同時(shí)根據(jù)PCR開展增加、標(biāo)記。
任意引物法
用任意引物法可將DIG-11-dUTP標(biāo)記于DNA鏈上。為獲得最好標(biāo)記實(shí)際效果，標(biāo)記前模版DNA需要做線形解決，并且最少要用甲酸-乙醚開展一次dna提取，再用酒精沉積。
100～10000堿基的模板鏈均可被合理地標(biāo)記，但超過10000堿基的模板鏈則必須在標(biāo)記前作限定酶切消化吸收。
解決好的模版添加任意引物，按堿基相輔相成標(biāo)準(zhǔn)，任意引物與模版DNA淬火后由Klenow精彩片段從引物3'端拓寬引物，便可將DIG-11-dUTP勻稱摻加到新合成的DNA鏈中。
創(chuàng)口移動(dòng)法
創(chuàng)口移動(dòng)法DNA技術(shù)性迅速簡單，且已十分完善。先用少量的DNaseI在雙鏈DNA上開啟多個(gè)多肽鏈空缺，
隨后在E.coliDNA聚合酶I的5'-3'外切活力和匯聚活力的相同的作用下，在空缺的5'端摘除單鏈DNA編碼序列，隨著由新合成的含有地高辛標(biāo)記的脫氧核苷酸鏈替代。
此方法適用環(huán)狀DNA或超過1kbDNA精彩片段的標(biāo)記。用以原位雜交的核苷酸探針，根據(jù)創(chuàng)口移動(dòng)法標(biāo)記更為合理。
由于此辦法可利用操縱DNaseI的酶促反應(yīng)獲得合理的空缺，進(jìn)而獲得長短尺寸合適的探針，而探針的高低是原位雜交的一個(gè)關(guān)鍵主要參數(shù)，充足小的探針才很有可能透過機(jī)構(gòu)或體細(xì)胞。
寡核苷酸探針的標(biāo)記方式
生成的寡核苷酸探針被普遍使用于挑選基因文庫、Southern印痕、Northern印痕、斑點(diǎn)印跡及原位雜交實(shí)驗(yàn)。
地高辛標(biāo)記寡核苷酸有三種方式:3'尾端標(biāo)記、5'尾端標(biāo)記及其在探針3'端再加上多個(gè)DIG-11-dUTP分子結(jié)構(gòu)的小尾巴。
3'尾端標(biāo)記法
3'尾端標(biāo)記法的主要特點(diǎn)是在每一個(gè)生成的寡核苷酸(長短為14～100bp)的3'尾端只加上一個(gè)地高辛殘基(DIG-ddUTP)。
用此方式標(biāo)記寡核苷酸時(shí),除尾端轉(zhuǎn)移酶外,不用其他非常的寡核苷酸生成實(shí)驗(yàn)試劑,省時(shí)省力。
所生成的探針合適于規(guī)定探針具備較高的非特異而敏感度一般的實(shí)驗(yàn),如Southern印痕、Northern印痕、斑點(diǎn)印跡及菌體P噬牙斑菌混種雜交試驗(yàn)。
5'尾端標(biāo)記法
5'尾端標(biāo)記法是根據(jù)有機(jī)化學(xué)辦法將地高辛標(biāo)記于寡核苷酸的5'尾端。最先在5'尾端聯(lián)接上一個(gè)羥基聯(lián)接臂殘基,將生成的寡核苷酸提純后,再使DIG-NHS與5'尾端的羥基殘基產(chǎn)生共價(jià)鍵融合,進(jìn)而產(chǎn)生標(biāo)記探針。
這類探針的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢是其3'端在DNA生成反映中當(dāng)做引物,使反映物質(zhì)得到標(biāo)記。
3'尾端加尾法
3'尾端加尾法是由尾端轉(zhuǎn)移酶在探針3'尾端再加上多個(gè)地高辛殘基的小尾巴。此方式標(biāo)記的探針敏感度較3'尾端標(biāo)記法要高于10倍上下,但因?yàn)榇嬗形舶?通常會(huì)產(chǎn)生較明顯的非特異性情況。
RNA探針的標(biāo)記方式
根據(jù)RNA聚合酶SP6、T7或T3經(jīng)身體之外基因表達(dá)可將地高辛標(biāo)記于RNA探針上。用地高辛標(biāo)記的RNA探針具備較強(qiáng)的數(shù)據(jù)信號(hào)工作能力,且非特異性情況少,
在Southern印痕和Northern印痕試驗(yàn)中,實(shí)際效果顯著好于同是地高辛標(biāo)記的DNA,可與放射性物質(zhì)放射性核素標(biāo)記探針相提并論。
此外,在挑選菌體P噬牙斑菌及原位雜交的試驗(yàn)中,RNA探針也一樣有著優(yōu)良的實(shí)際效果。并且,因?yàn)镈IG與UTP中間的鍵合對(duì)偏堿不比較敏感,可根據(jù)堿解決方式獲得所需尺寸的探針。
